飛凡檢測: | 病毒滅活 |
單價: | 5000.00元/件 |
發(fā)貨期限: | 自買家付款之日起 天內(nèi)發(fā)貨 |
所在地: | 江蘇 蘇州 吳江 |
有效期至: | 長期有效 |
發(fā)布時間: | 2023-12-21 02:55 |
最后更新: | 2023-12-21 02:55 |
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飛凡檢測可依據(jù)YY/T 0606.25-2014 進(jìn)行動物源性生物材料DNA殘留量測定法:熒光染色法試驗,動物源性生物材料DNA殘留量測定法:熒光染色法試
YY/T 0606.25-2014標(biāo)準(zhǔn)試驗過程解析
飛凡檢測試驗步驟:
本試驗方法所采用的實驗方案包括三個步驟:(1)動物源性生物材料的蛋白酶K消化(適用于固體或膠體狀材料),(2)消化后樣品的DNA純化(磁珠吸附法),(3)純化后樣品的 DNA 殘留量測定(熒光染色法)。試驗樣品除供試品之外,需同步設(shè)定回收率試驗樣品(使用標(biāo)準(zhǔn)品Lambda DNA)。
材料:試劑和儀器
準(zhǔn)備:
試劑:1(蛋白酶K消化用試劑:蛋白酶K(-20?保存,避免反復(fù)凍存和融化),蛋白酶K
緩沖液。 2(DNA純化用試劑:磁珠(4?保存)、裂解液、DNA結(jié)合液、漂洗液、溶出液(室溫保存)。3(熒光染色法檢測試劑:PicoGreen 染料。
儀器:磁力架,96 孔板(黑色),熒光酶標(biāo)儀,DNase-free無菌離心管;吸頭,冷凍離心機(jī),震蕩器,漩渦混懸器,高精度天平(0.00001g)
飛凡檢測試驗步驟:
注明:以下試驗過程中必須采取防止 DNAase 污染的措施,如:戴手套操作、使用沒有 DNAase 污染的專用實驗臺和實驗用具及儀器。
1.干燥型樣品:取供試品(100 ug),jingque稱重并記錄,放進(jìn)1.5 mL DNase-free無菌離心管內(nèi),用無菌眼科剪將樣品剪裁成適當(dāng)大小,加 DEPC水至180UL,于冰箱內(nèi)放置 12,24 小時,使樣品充分水和、軟化。
2.濕潤型樣品:取供試品(1 cm),放于1.5 mLDNase-free無菌離心管內(nèi).13000rpm/min 離心10 min,去除液體部分。另取與上述同樣大小的樣品,分別放于1.5mLDNase-free無菌離心管內(nèi),13000rpm/min離心10min,去除液體部分后以開蓋狀態(tài)放在安全柜內(nèi),令其室溫內(nèi)自然干燥24 小時,然后jingque稱重并記錄,用于樣品干重單位重量內(nèi)DNA殘留量的計算。
3.膠體型樣品:jingque量取供試品 100 uL,放于1.5 mLDNase-free無菌離心管內(nèi),可直接進(jìn)行下一步實驗。
注:膠體型樣品:以單位體積的殘留 DNA 含量表示最終結(jié)果。
4. 骨質(zhì)類樣品:對于諸如同種異體骨等骨植入物樣品應(yīng)參照GA/T 383-2002中華人民共和國公共安全
注:每份樣品設(shè)平行樣三份,最終測定結(jié)果取其平均值。
5.將上述供試品剪成盡量小的碎片后,加蛋白酶K緩沖液(10xProteinase K buffer)20uL,蛋白酶K(20mg/mL)10uL,加DEPC水至最終反應(yīng)體積為210u L。
注:液態(tài)狀樣品不需要蛋白酶K消化,可直接進(jìn)行后續(xù)的 DNA 純化試驗。
6.取DNA 標(biāo)準(zhǔn)品(Lambda DNA standard)400ng、200ng、100ng、50ng、25ng、Ong,用DEPC水稀釋至100uL,分別加在1.5 mLDNase-free無菌離心管內(nèi),添加蛋白消化酶K緩沖液20u L,蛋白酶K(20 mg/mL)10u L,3% BSA 80uL(目的是保證與供試品反應(yīng)系統(tǒng)相同),至最終反應(yīng)體積為 210uL。
7.依據(jù)所選擇的方法及使用的試劑盒所附的操作方法進(jìn)行 DNA純化。
TMTM 舉例:使用核酸提取試劑盒(PrepSE Acid Extraction
Kit)進(jìn)行DNA純化 , 在上述各樣品中分別加入裂解液 400uL,震蕩10秒鐘使樣
品充分混勻,室溫放置10min,使樣品完全溶解(最多可放置 1-2 小時,直至樣品完全溶解)。
8.取出裝有磁珠的離心管,以“最大速度”震蕩 10 秒鐘混勻后,取30uL磁珠液分別加入上述各樣品內(nèi),“低速”震蕩 10 秒鐘混勻。加入 400u L結(jié)合液(異丙醇),震蕩5秒鐘。室溫下震蕩(1000 rpm/min)孵育10分鐘。再次低速震蕩 10 秒鐘后,將內(nèi)裝樣品的離心管放在磁力架上,收集結(jié)合有DNA 的磁珠,去除上清液。 漂洗 DNA:加入300uL洗液,低速震蕩10秒鐘后,將內(nèi)裝樣品的離心管放在磁力架上,收集結(jié)合有 DNA的磁珠,去除上清液。
9.重復(fù)步驟:漂洗DNA,至少2次。使結(jié)合有 DNA 的磁珠在室溫下干燥5分鐘。溶出DNA:加入50uL溶出液,中速震蕩5分鐘,于70度水浴槽內(nèi)孵育5分鐘,中速震蕩2秒鐘后,將內(nèi)裝樣品的離心管放在磁力架上,分離 DNA。
飛凡檢測數(shù)據(jù)分析
本試驗方法中回收率試驗最低樣本量為 6.25 ng DNA,低于6.25 ng 時回收率明顯下降,不能滿足良好的準(zhǔn)確性和精密度。因此,本試驗方法中適宜的樣本量為?6.25 ng DNA/樣品。若樣品中 DNA殘留量低于 6.25 ng DNA/樣品時,應(yīng)加大樣品的取樣量,同時相應(yīng)地擴(kuò)大蛋白酶K消化時的反應(yīng)體積。
如果在最大取樣量的條件下仍不能滿足上述條件,則只能報告未經(jīng)回收率校正的檢測值作為參考資料,此種情況在最終報告中應(yīng)注明。