安徽間充質(zhì)干細胞外泌體提取暨南大學
安徽
間充質(zhì)干細胞外泌體提取
暨南大學
外泌體
外泌體是指包含了復雜 RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡 (30-150nm)，現(xiàn)今，其特指直徑在40-100nm的盤狀囊泡。
1983年，外泌體首次于綿羊
網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)， 1987年Johnstone將其命名為“exosome”。
多種細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。
其主要來源于細胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中 。
安徽間充質(zhì)干細胞外泌體提取暨南大學
所有培養(yǎng)的細胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。
有關他們分泌和攝取及其組成、“運載物”和相應功能的分子機制剛剛開始研究。
外泌體被視為特分泌的膜泡，參與細胞間通訊，對外泌體的研究興趣日益增長，無論是研究其功能還是了解如何將其用于微創(chuàng)診斷的開發(fā)。
外泌體富含膽固醇和鞘磷脂。
2007年， Valadi等發(fā)現(xiàn)鼠的
肥大細胞分泌 的 exosome可以被人的肥大細胞捕獲，并且其攜帶的mRNA成分可以進入細胞漿中可以被翻譯成蛋白質(zhì)，不僅僅是mRNA，exosomes所轉(zhuǎn)移的microRNA同樣具有
生物活性，在進入靶細胞后可以靶向調(diào)節(jié)細胞中mRNA的水平。
這一發(fā)現(xiàn)使得研究人員對exosome的研究熱情激增，截止已經(jīng)通過286項研究發(fā)現(xiàn)了41860種蛋白質(zhì)、2838種microRNA、3408種mRNA。
一類外泌體中常見的細胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白，是鳥苷酸三磷酸酶(GTPases,)家族的一種。
它可以調(diào)節(jié)外泌體膜與
受體細胞的融合，有文獻報道稱RAB4, RAB5和 RAB11主要出現(xiàn)于早期以及回收的核內(nèi)體中，RAB7 和 RAB9主要出現(xiàn)于晚期的核內(nèi)體。
現(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種RAB蛋白。
除了RAB蛋白，外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白（包括膜聯(lián)蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。
外泌體膜上富含參與外泌體運輸?shù)乃目缒さ鞍准易澹–D63, CD81 和CD9)）、
熱休克蛋白家族（(HSP60, HSP70, HSPA5, CCT2 和HSP90以及一些細胞特的蛋白包括A33（結(jié)腸上皮細胞來源）、MHC-Ⅱ(
抗原提呈細胞來源)、CD86(抗原提呈細胞來源)以及乳凝集素（不成熟的樹突狀細胞）。
其它一些外泌體中的蛋白包括多種的代謝類的酶（GAPDH, 烯醇化酶 1, 醛縮酶 1, PKM2, PGK1, PDIA3, GSTP1,DPP4, AHCY, TPL1, 抗氧化蛋白, P4HB, LDH, 親環(huán)素 A,FASN, MDH1 和CNP）、核糖體蛋白（RPS3）、信號轉(zhuǎn)導因子（黑色素瘤分化相關因子, ARF1, CD2, 人類紅細胞膜整合蛋白, SLC9A3R1）、粘附因子（MFGE8、整合素）、細胞骨架蛋白以及泛素等。
外泌體的提取主要包括以下幾種方式。
一是超速離心法，這是外泌體提取最常用的方法 。
此種方法得到的外泌體量多，但是純度不足，電鏡鑒定時發(fā)現(xiàn)外泌體聚集成塊， 由于微泡和外泌體沒有非常統(tǒng)一的鑒定標準，也有一些研究認為此種 方法得到的是微泡不是外泌體 。
二是過濾離心， 這種操作簡單、省時，不影響外泌體的生物活性 ，但同樣存在純度不足的問題。
三是
密度梯度離心法， 用此種方法分離到 的外泌體純度 高，但是前期準備工作繁雜，耗時，量少。
四是
免疫磁珠法，這種方法可以保證外泌體形態(tài) 的完整，特高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設備，但是非中性pH 和非 生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性， 不便進行下一步的實驗 。
五是PS親和法，該方法將PS（
磷脂酰絲氨酸）與磁珠結(jié)合，利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。
該方法與免疫磁珠法相似，獲得的外泌體形態(tài)完整，純度。
由于不使用變性劑，不影響外泌體的生物活性，外泌體可用于細胞共培養(yǎng)和體內(nèi)注射。
2016.9 《Scientific Reports》 雜志發(fā)表了該方法數(shù)據(jù)，表明PS法可提取相當高純度的外泌體。
六是色譜法，這種方法分離到的外泌體在 電鏡下大小均 一， 但是需要特殊的設備 ， 應用不廣泛 。
